摘要：从上海市老港垃圾填埋场的污泥和垃圾渗滤液中分离筛选得到数株具有较强除臭能力的菌株，并制成复合微生物除臭剂，考察了该除臭剂对污泥和垃圾释放ＮＨ３以及恶臭气体浓度等的去除效果，并结合聚合酶链式反应（ＰＣＲ）-变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术对该除臭剂的微生物群落结构进行分析，初步探究其除臭机制。结果表明：（１）实验室小试时，４８ｈ，复合微生物除臭剂对污泥释放ＮＨ３的去除率维持在３０％～４５％，对垃圾释放ＮＨ３的去除率维持在２５％～３５％，去除效果好于ＥＭ菌剂。（２）污泥中转码头１００ｔ污泥中试试验表明，在复合微生物除臭剂投加量为０．５ｔ条件下，２４ｈ后复合微生物除臭剂对ＮＨ３的去除率达到３７．５％，恶臭气体浓度下降了１９．１％。（３）ＰＣＲ-ＤＧＧＥ结果显示，复合微生物除臭剂的优势菌种为产碱杆菌、芽孢杆菌和显核菌，与ＥＭ菌剂差异较明显，且Ｓｈａｎｎｏｎ-Ｗｉｅｎｅｒ多样性指数明显高于ＥＭ菌剂。其除臭机制可能为化学吸收与微生物降解、抑制的联合作用除臭。 关键词：填埋场；恶臭气体；微生物除臭剂；微生物群落结构；除臭机制 近年来，随着城市化进程的加快、城市人口日益增多，生活垃圾产量以８％～１０％的速度迅速增加，其中９５％以上的生活垃圾是经填埋处理的。然而，填埋过程中会产生大量有毒有害的恶臭气体，可能对人类生存及环境可持续发展造成严重影响。与传统的物理、化学除臭方法相比，生物除臭法具有处理效率高、无二次污染、工艺简单、适应范围广及费用低廉等优点，已被广泛使用并得到迅速发展，该方法中的ＥＭ菌群已有较成熟的应用。但是由于微生物除臭技术存在筛选高效菌种难、见效慢，特别是针对成分复杂的垃圾除臭的微生物制剂较少，已有的微生物菌剂往往不能适应填埋场的恶劣环境，因此研发具有针对性的高效菌剂仍是研究热点之一。 本研究从上海市老港垃圾填埋场的污泥和垃圾渗滤液中分离和筛选有效除臭菌株，并制成复合微生物除臭剂，通过实验室模拟小试和现场中试研究其对填埋场ＮＨ３及恶臭气体浓度等的去除效果，并结合聚合酶链式反应（ＰＣＲ）-变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术分析了复合微生物除臭剂的微生物群落结构，初步探究了其除臭机制。 １材料与方法 １．１试验材料 １．１．１主要试验材料来源 试验用垃圾是上海市老港垃圾填埋场刚收集的新鲜生活垃圾。 试验用污泥是上海市老港垃圾填埋场垃圾渗滤液处理工艺产生的剩余污泥。 研究菌种从上海市老港垃圾填埋场的污泥和新鲜垃圾渗滤液中分离和筛选；ＥＭ菌剂购自上海某公司。 １．１．２菌种分离所用培养基 （１）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏（５ｇ）、蛋白胨（１０ｇ）、琼脂（２０ｇ）、氯化钠（５ｇ）、蒸馏水（１０００ｍＬ），ｐＨ（７．０～７．２），１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。 （２）营养肉汤培养基：蛋白胨（１０ｇ）、牛肉粉（５ｇ）、氯化钠（５ｇ）、蒸馏水（１０００ｍＬ），ｐＨ（７．２±０．２），１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。 １．２试验方法 １．２．１菌种的分离与纯化 将取自垃圾填埋场的新鲜污泥或新鲜垃圾渗滤液用无菌水稀释成１０－２的溶液，采用平板涂布法将上述溶液分别涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，倒置于３７℃恒温培养箱（ＳＰＸ-２５０Ｂ-Ｇ）中培养２４ｈ。将牛肉膏蛋白胨培养基中的菌落采用平板稀释分离法进一步纯化，直到获得纯培养。分别转移特征不同的菌落到相应的牛肉膏蛋白胨培养基上斜面培养后，保存备用。 １．２．２菌种的筛选 先将分离得到的菌株，分别接种到营养肉汤培养基中，置于２２０ｒ／ｍｉｎ摇床（ＨＺＱ-ＦＸ）上３０℃恒温培养５ｄ得到培养物。 在５Ｌ带塞的广口瓶中加入５０ｇ新鲜污泥，按投加比为１０．０％（质量分数）喷洒培养物，以加自来水作对照，每个处理设３个重复。分别在间隔１２、２４、４８ｈ后用恶臭气体浓度测定仪（ＸＰ-３２９Ⅲｓｅｒｉｅｓ）测定恶臭气体浓度，以判定菌株的除臭效果。 １．２．３复合微生物除臭剂的制备 将筛选出来的具有明显除臭能力的微生物菌种经斜面活化后，接种到装有５００ｍＬ营养肉汤培养基的三角瓶中，置于２２０ｒ／ｍｉｎ摇床上３０℃恒温条件下，培养至对数生长期（３～７ｄ），即得复合微生物除臭剂。 １．２．４复合微生物除臭剂除臭效果评价 （１）实验室小试试验 取１００ｇ新鲜污泥或５００ｇ新鲜垃圾平摊于４个培养皿中后，按投加比为０．５％喷洒除臭剂，放于塑料袋中，充气６０Ｌ后扎紧密封。分别设置投加ＥＭ菌剂和自来水作为对照。每个处理设３个重复。每隔一段时间用ＮＨ３速测仪（ＧＤＹＫ-３０１Ｓ）测定其ＮＨ３浓度，以比较不同除臭剂对ＮＨ３的去除效果。 （２）中试试验 为考察复合微生物除臭剂在实际运用中的除臭效果，选择了某污泥中转码头的污泥池进行试验研究。池内共有污泥２００ｔ，将其中１００ｔ装船，在污泥装船过程中喷洒除臭剂，共喷洒０．５ｔ，船上喷洒除臭剂的污泥为试验组。污泥池剩余１００ｔ污泥不喷洒除臭剂作为对照组。２４ｈ后各检测一次ＮＨ３、Ｈ２Ｓ以及恶臭气体浓度，考察除臭效果。 １．２．５复合微生物除臭剂中微生物群落结构分析 应用ＰＣＲ-ＤＧＧＥ技术分析复合微生物除臭剂中的微生物构成和多样性，以探究其除臭机制。采用细菌基因组ＤＮＡ抽提试剂盒分别提取复合微生物除臭剂以及ＥＭ菌剂的ＤＮＡ后，采用细菌１６ＳｒＤＮＡＶ３区通用引物Ｆ３５７-ＧＣ（５’ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣ-ＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ３’）及Ｒ５１８（５’ＡＴＴＡＣＣＧＣＧ-ＧＣＴＧＣＴＧＧ３’）对样品进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体系为：４种脱氧核苷酸的混合物（ｄＮＴＰｓ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ（不含Ｍｇ２＋）５μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ，上游引物Ｆ３５７-ＧＣ（２０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，下游引物Ｒ５１８（２０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，模版ＤＮＡ２μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，加双蒸水补至５０Ｌ。反应程序：９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５７℃退火４５ｓ，７２℃延伸４０ｓ，共３５个循环，７２℃下延伸７ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增结果通过１％（质量分数）的琼脂糖凝胶电泳进行检测。 采用Ｂｉｏ-Ｒａｄ公司的Ｄｃｏｄｅ基因突变检测系统对ＰＣＲ反应产物进行ＤＧＧＥ分离。ＤＧＧＥ所用的凝胶质量分数为８％，其变性梯度范围为３７％～５５％。上样量为６μＬ上样染料和３０μＬＰＣＲ产物。其运行条件：在１×ＴＡＥ电泳缓冲液（２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ冰乙酸，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ），ｐＨ７．４）中，６０℃条件下，２００Ｖ运行３ｍｉｎ，然后１８０Ｖ运行２７０ｍｉｎ。ＤＧＧＥ完成后，取胶用含ＧｅｌＲｅｄ的溶液染色３０ｍｉｎ。采用美国Ｔａｎ-ｎｏｎ公司的Ｇｅｌ-Ｄｏｃ２０００凝胶成像系统，获取胶图。 将ＤＧＧＥ凝胶中具有代表性的特异性条带切下，回收其中的ＤＮＡ，并以其为模板，Ｆ３５７（５’ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ３’）与Ｒ５１８为引物，进行ＰＣＲ扩增。取扩增成功的ＰＣＲ产物进行测序。 ２结果与分析 ２．１除臭菌株的筛选 经过多次分离和筛选，得到数株具有明显除臭能力的菌株。小试试验结果表明，这些菌株１２ｈ后对恶臭气体浓度的去除率在１０％～１５％；随着时间的延长，除臭效果逐渐上升，４８ｈ后恶臭气体浓度的去除率维持在２０％～３４％。筛选的这几株菌株对恶臭气体浓度均具有一定的去除效果，考虑将其复配使用。 ２．２复合微生物除臭剂的实验室小试除臭效果 通过实验室小试研究了复合微生物除臭剂（投加比为０．５％）对污泥及垃圾释放ＮＨ３的除臭效果，并与ＥＭ菌剂的除臭效果进行了比较，结果如图１和图２所示。 从图１和图２可以看出，复合微生物除臭剂和ＥＭ菌剂对污泥及垃圾释放的ＮＨ３均具有一定的去除作用，且复合微生物除臭剂的去除效果稍优于垃圾填埋场目前使用的ＥＭ菌剂。４８ｈ，复合微生物除臭剂对污泥释放ＮＨ３的去除率维持在３０％～４５％，对垃圾释放ＮＨ３的去除率维持在２５％～３５％；ＥＭ菌剂对污泥和垃圾释放ＮＨ３的去除率分别为２２％～２８％、２０％～２４％。此外，复合微生物除臭剂对ＮＨ３的去除率逐渐增大，而ＥＭ菌剂对ＮＨ３的去除率则呈现逐渐降低的趋势，其原因可能为前期ＮＨ３的去除主要是由吸收作用完成；后期吸收饱和后，由于复合微生物除臭剂是从垃圾渗滤液或污泥中筛选而来，相对于ＥＭ菌，其对于垃圾具有较强的针对性，可以更高效地利用恶臭物质。 ２．３复合微生物除臭剂的中试除臭效果 表１为复合微生物除臭剂对某污泥中转码头１００ｔ污泥的除臭效果。从表１可以看出，２４ｈ后，复合微生物除臭剂对ＮＨ３的去除率达到３７．５％，恶臭气体浓度也下降了１９．１％。陆文龙等采用复合微生物除臭剂进行现场试验，结果表明，在５ｄ后复合微生物除臭剂对污泥填埋单元中Ｈ２Ｓ、ＮＨ３、ＣＳ２和恶臭气体浓度的抑制率分别为１２．６％～２９．７％、１９．７％～５６．１％、１．０％～１１．１％和５７．８％～６５．３％；在４８ｈ内，对生活垃圾集装箱中Ｈ２Ｓ、ＮＨ３、ＣＳ２和恶臭气体浓度的抑制率分别为２５．９％～５２．８％、２３．６％～６０．０％、０．７％～２９．７％和２５．０％～５７．８％。由此可见，复合微生物除臭剂具有较好的除臭效果，在实际垃圾恶臭污染控制方面具有潜在的应用价值。 ２．４复合微生物除臭剂的群落结构分析与除臭机制研究 ＰＣＲ-ＤＧＧＥ技术常用来分析环境样品中微生物菌落构成的多样性。为了探究复合微生物除臭剂的除臭机制，对复合微生物除臭剂的菌群进行了群落结构分析。复合微生物除臭剂及ＥＭ菌剂中细菌ＰＣＲ扩增产物的ＤＧＧＥ图谱见图３，其中ＤＧＧＥ条带测序结果见表２。
从图３可以看出，两种不同除臭剂的菌种丰富度都较低，微生物组成较简单。但是两种除臭剂条带之间差异较明显，Ｓｈａｎｎｏｎ-Ｗｉｅｎｅｒ多样性指数计算得出复合微生物除臭剂的Ｓｈａｎｎｏｎ-Ｗｉｅｎｅｒ多样性指数为２．１４，高于ＥＭ菌剂（１．７５）。经测定，复合微生物除臭剂的ｐＨ为３．０～４．０，ＥＭ菌剂的ｐＨ为３．０，表明这些菌种在培养过程中会产酸，在强酸性环境中，不耐酸的微生物生长会受到抑制，因此ＥＭ菌剂中的Ｓｈａｎｎｏｎ-Ｗｉｅｎｅｒ多样性指数较低。 本研究中对主要条带割胶测序，结果表明，复合微生物除臭剂中优势菌种为产碱杆菌属、芽孢杆菌属和显核菌属，而ＥＭ菌剂中主要含有乳酸杆菌属，这些菌在发酵过程中会产生大量的酸性物质，降低ＥＭ菌剂的ｐＨ。根据以往报道，芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊）、显核菌、巴斯（氏）德菌、乳酸杆菌、链球菌、红螺菌以及醋杆菌等在微生物除臭方面具有较好的效果。 结合两种不同除臭剂的除臭效果试验及对其中微生物群落结构的研究，推测恶臭气体的去除可能主要是化学吸收与微生物降解、抑制的联合作用。两种除臭剂都呈现较强的酸性，因此在投加除臭剂后，ＮＨ３等碱性气体被大量吸收，有效降低了释放到环境中的恶臭气体浓度。同时，酸性环境能有效抑制恶臭气体产生微生物的代谢活动，改善有机物的分解途径，减少ＮＨ３和Ｈ２Ｓ等的释放量和胺类物质的产生。随时间的延长，除臭剂对ＮＨ３等碱性气体逐渐达到吸收饱和状态，后期主要是靠微生物降解作用去除ＮＨ３，即以ＮＨ＋４的形态被微生物吸收，作为营养物质通过新陈代谢作用为微生物所分解、利用，最终将其氧化分解为ＣＯ２、Ｈ２Ｏ、ＮＯ－２、ＮＯ－３、Ｓ、ＳＯ２－３、ＳＯ２－４等，从而使恶臭物质得以去除。 ３结论 （１）从填埋场污泥和垃圾渗滤液中分离筛选得到数株具有较强除臭能力的菌株，并制成复合微生物除臭剂。实验室小试时，４８ｈ，复合微生物除臭剂对污泥释放ＮＨ３的去除率维持在３０％～４５％，对垃圾释放ＮＨ３的去除率维持在２５％～３５％，去除效果好于ＥＭ菌剂。 （２）污泥中转码头１００ｔ污泥中试试验表明，在复合微生物除臭剂投加量为０．５ｔ条件下，２４ｈ后复合微生物除臭剂对ＮＨ３的去除率达到３７．５％，恶臭气体浓度下降了１９．１％。 来源《换进污染与防治》
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